In situ υβριδισμός

ο in situ υβριδισμός είναι μια μέθοδος για την ανίχνευση χρωμοσωμικών εκτροπών. Ορισμένα χρωμοσώματα επισημαίνονται με φθορίζουσες βαφές και συνδέονται με έναν ανιχνευτή DNA. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται για την προγεννητική διάγνωση γονιδιακών μεταλλάξεων.

Τι είναι ο υβριδισμός in situ;

Με in situ υβριδισμό ή το Υβριδισμός επί τόπου φθορισμού νουκλεϊκά οξέα από RNA ή DNA ανιχνεύονται σε ορισμένους ιστούς ή ένα κύτταρο χρησιμοποιώντας μοριακές γενετικές μεθόδους. Συνήθως αυτός ο τύπος διάγνωσης χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μιας δομικής ή αριθμητικής χρωμοσωμικής ανωμαλίας κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης.

Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιείται ένας τεχνητά κατασκευασμένος ανιχνευτής, ο οποίος αποτελείται από νουκλεϊκό οξύ. Στη συνέχεια συνδέεται με τα νουκλεϊκά οξέα στον οργανισμό μέσω της σύζευξης βάσεων. Αυτός ο δεσμός εννοείται με τον όρο υβριδοποίηση. Τα στοιχεία βασίζονται στη ζωντανή δομή του ασθενούς και επομένως αντιστοιχεί σε επιτόπια στοιχεία. Αυτό πρέπει να διακρίνεται από τις in-vitro μεθόδους στις οποίες η ανίχνευση πραγματοποιείται στον δοκιμαστικό σωλήνα. Η μέθοδος αναπτύχθηκε τον 20ο αιώνα από τους επιστήμονες Joe Gall και Mary Lou Pardue.

Η τεχνολογία έχει εξελιχθεί από τότε. Ενώ χρησιμοποιήθηκαν ραδιενεργά ανιχνευτές τότε, για παράδειγμα, σημασμένοι με φθορισμό ανιχνευτές με ομοιοπολικό δεσμό με τα μόρια επισήμανσης χρησιμοποιούνται σήμερα.

Λειτουργία, αποτέλεσμα και στόχοι

Ο υβριδισμός in situ συνήθως χρησιμοποιείται για την ανίχνευση χρωμοσωμικών εκτροπών, δηλαδή χρωμοσωμικών ανωμαλιών που δεν μπορούν να ανιχνευθούν σε καρυόγραμμα. Η μέθοδος χρησιμοποιείται επομένως πάντα όταν οι κληρονομικές ασθένειες πρέπει να προσδιορίζονται κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης.

Δεδομένου ότι οι εκτροπές χρωμοσωμάτων είναι ένα πρόβλημα που δεν πρέπει να υποτιμηθεί σήμερα, η χρήση της μεθόδου έχει αυξηθεί με την πάροδο του χρόνου. Ο υβριδισμός πραγματοποιείται με βάση τα φυσικά κύτταρα από το αμνιακό υγρό της μητέρας. Η βάση της τεχνολογίας είναι η σύνδεση του ανιχνευτή με σήμανση χρώματος στα μέρη του DNA. Χάρη στη δέσμευση, ο αριθμός των αντιγράφων μπορεί αργότερα να αξιολογηθεί με ένα μικροσκόπιο, καθώς τα μεμονωμένα αντίγραφα εκπέμπουν ένα φωτεινό σήμα και μπορούν έτσι να γίνουν ορατά κάτω από το μικροσκόπιο. Υπάρχουν διαφορετικές διαδικασίες. Είτε η ανάλυση πραγματοποιείται αμέσως μετά τη δέσμευση.

Σε αυτήν την περίπτωση, χρησιμοποιείται φθορίζουσα βαφή όπως βιοτίνη, η οποία συνδέεται απευθείας με τον ανιχνευτή DNA. Με την έμμεση μέθοδο in situ υβριδισμού, η αξιολόγηση δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί αμέσως μετά τον υβριδισμό, καθώς οι φθορίζουσες ουσίες μπορούν να συνδεθούν μόνο στον ανιχνευτή μετά τον υβριδισμό. Αυτή η έμμεση μέθοδος χρησιμοποιείται συχνότερα από την άμεση, επειδή πιστεύεται ότι είναι πιο ευαίσθητη. Εκτός από τους ανιχνευτές ϋΝΑ του ειδικού για το χρωμόσωμα, υπάρχουν επίσης ανιχνευτές ϋΝΑ ειδικού για τόπους, ανιχνευτές ϋΝΑ ειδικής για χρωμόσωμα και συγκριτικοί υβριδοποιήσεις γονιδιώματος.

Οι ανιχνευτές DNA του συγκεκριμένου χρωμοσώματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση χρωμοσωμικών αριθμητικών ανωμαλιών. Αυτό σημαίνει ότι χρησιμοποιούνται κυρίως όταν υπάρχει υποψία διπλασιασμένων ή διαγραμμένων χρωμοσωμάτων. Οι ανιχνευτές DNA για συγκεκριμένη θέση είναι ιδιαίτερα κατάλληλοι για την ανίχνευση ελάχιστων μεταλλάξεων που δεν μπορούν να ανιχνευθούν στο καρυόγραμμα. Ένας ειδικός για χρωμόσωμα ανιχνευτής βιβλιοθήκης DNA χρησιμοποιείται ειδικότερα για την ανίχνευση παρεμβολών και μετατοπίσεων.

Η συγκριτική υβριδοποίηση γονιδιώματος, από την άλλη πλευρά, είναι μια ολοκληρωμένη ανάλυση των απωλειών και των κερδών στο χρωμοσωμικό υλικό. Σήμερα, ο επιτόπιος υβριδισμός είναι πολύ σημαντικός στη διάγνωση διαφόρων μεταλλάξεων χρωμοσωμάτων.Στη διάγνωση του συνδρόμου Down, για παράδειγμα οι ανιχνευτές συνδέονται με το χρωμόσωμα 21. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιούνται συνήθως ειδικοί ανιχνευτές χρωμοσωμάτων, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν εάν υπάρχει υποψία αυτής της ασθένειας.

Μπορεί να προκύψει υποψία, για παράδειγμα, εάν οι γονείς είχαν προηγουμένως γεννήσει ένα παιδί με την ασθένεια και η εικόνα υπερήχων είναι ανώμαλη. Εάν υπάρχει τριπλό αντί διπλού δεσμού και συνεπώς εξάγεται σήμα τριπλού χρώματος, η διάγνωση θεωρείται επιβεβαιωμένη.

Κίνδυνοι, παρενέργειες & κίνδυνοι

Σε αντίθεση με, για παράδειγμα, την PCR, ο υβριδισμός in-situ είναι σημαντικά λιγότερο επιρρεπής σε μόλυνση. Επιπλέον, ο χρόνος που απαιτείται για τη διαδικασία είναι πολύ μικρότερος. Ωστόσο, επειδή τα έμβρυα σχηματίζουν συγκεκριμένα πρότυπα χρωμοσωμάτων, ένα σχέδιο δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστεί με βεβαιότητα το υπόλοιπο της χρωμοσωμικής κατανομής και συνεπώς η γενετική κατάσταση άλλων κυττάρων.

Τα χρωματικά σήματα μπορούν επίσης να αλληλεπικαλύπτονται ή να παραμένουν αόρατα για άλλους λόγους. Ως αποτέλεσμα, ο in situ υβριδισμός ως διαγνωστικό εργαλείο είναι σχετικά επιρρεπής σε σφάλματα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Μπορεί να προκύψουν λανθασμένες διαγνώσεις και οι γονείς μπορούν να αποφασίσουν κατά ενός υγιούς εμβρύου. Προκειμένου να μειωθεί ο ρυθμός σφάλματος της in situ υβριδοποίησης, τουλάχιστον δύο εμβρυϊκά κύτταρα πρέπει να εξεταστούν ταυτόχρονα. Εξετάζοντας παράλληλα δύο κύτταρα, υπάρχει μόνο ένας αμελητέος κίνδυνος εσφαλμένης διάγνωσης.

Σε μια τέτοια περίπτωση, οι γονείς μπορούν να βασίζονται απολύτως στη διάγνωση. Ο υβριδισμός in-situ δεν προσφέρεται σε κάθε έγκυο γυναίκα, αλλά μόνο σε γυναίκες από ομάδα κινδύνου. Παρ 'όλα αυτά, οι έγκυες γυναίκες δεν αρνούνται αυτόν τον τύπο διάγνωσης κατόπιν αιτήματός τους. Μη φυσιολογικά ευρήματα υπερήχων ή ανώμαλος ορός μπορεί να ωθήσει έναν γιατρό να προσφέρει τη διαγνωστική διαδικασία. Αν και ένα μεγάλο μέρος, αλλά καθόλου, οι χρωμοσωμικές παρεκκλίσεις μπορούν να διαγνωστούν χρησιμοποιώντας υβριδοποίηση in situ.

Επομένως, ο επιτόπιος υβριδισμός δεν πρέπει ποτέ να πραγματοποιείται μόνος του, αλλά πρέπει πάντα να χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με μια συμβατική δοκιμή χρωμοσωμάτων. Η φροντίδα της εγκύου παίζει σημαντικό ρόλο σε αυτήν τη διαδικασία. Πριν από την ανάλυση, υπάρχει μια εις βάθος συζήτηση με την μέλλουσα μητέρα σχετικά με τη διαγνωστική μέθοδο, η οποία εξηγεί τους κινδύνους, τις δυνατότητες και τα όρια της τεχνολογίας.